焦磷酸测序 (pyrosequencing) 的基本原理是：
①一条特异性测序引物与单链模板 DNA 退火后，加入酶混合物和底物混合物，其中酶混合物中包括 DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）；底物混合物中包括 5＇-磷酸化硫酸腺苷（adenosine 5＇-sul-phatophosphate，APS）和荧光素。
②向反应体系中加入 1 种 dNTP，如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的 3＇-末端，同时释放出一分子 PPi。
③在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP。在荧光素酶的催化下，ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素，同时发光，最大波长约为 560nm，荧光信号强度（即检测峰值的高低）与聚合的 dNTP 个数呈正比。
④反应体系中剩余的 dNTP 和残留的 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。
⑤加入另一种 dNTP，重复第②～④步反应。通过这种循环反应，根据加入的 dNTP 类型和荧光信号强度（峰值的高低），就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。
原理如图所示：